Análisis exhaustivo de la codificación y no

Apr 26, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9252 (2023) Citar este artículo

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La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno autosómico recesivo con base genética. El síntoma no motor predominante de la EW es la disfunción cognitiva, aunque el mecanismo regulador genético específico sigue sin estar claro. Los ratones Tx-J, con una homología de secuencia del 82% del gen ATP7B con el gen humano, se consideran el modelo más adecuado para WD. Este estudio emplea secuenciación profunda para investigar las diferencias en los perfiles de transcripción de ARN, tanto codificantes como no codificantes, así como las características funcionales de la red reguladora involucrada en el deterioro cognitivo de WD. La función cognitiva de los ratones tx-J se evaluó mediante la prueba del laberinto de agua (WMT). Se analizaron perfiles largos de ARN no codificante (lncRNA), ARN circular (circRNA) y ARN mensajero (ARNm) en el tejido del hipocampo de ratones tx-J para identificar ARN expresados ​​diferencialmente (ARN-DE). Posteriormente, los DE-RNA se usaron para construir redes de interacción proteína-proteína (PPI), así como redes de expresión de ARN endógeno (ceRNA) competitivo asociado a DE-circRNA y lncRNA, y redes de coexpresión codificante-no codificante (CNC). Para dilucidar sus funciones y vías biológicas, las redes de PPI y ceRNA se sometieron a análisis de vías de Ontología de genes (GO) y Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG). Un total de 361 ARNm expresados ​​diferencialmente (ARNm DE), que comprenden 193 ARNm regulados al alza y 168 regulados a la baja, 2627 ARN no codificantes largos expresados ​​diferencialmente (ARNlDE-), que consisten en 1270 regulados al alza y 1357 regulados a la baja Se observaron lncRNA y 99 ARN circulares expresados ​​diferencialmente (DE-circRNA), que consisten en 68 circRNA regulados al alza y 31 regulados a la baja, en el grupo de ratones tx-J en comparación con el grupo de ratones de control. La ontología génica (GO) y los análisis de vías revelaron que los ARNm DE se enriquecían en los procesos celulares, las vías de señalización del calcio y las vías de vigilancia del ARNm. Por el contrario, la red de ARN endógeno competitivo asociado a DE-circRNAs (ceRNA) se enriqueció para la modificación de cromatina covalente, la modificación de histonas y la guía de axones, mientras que la red de ceRNA asociada a DE-lncRNAs se enriqueció para la columna dendrítica, la regulación de la morfogénesis celular involucrada en la diferenciación y la vía de vigilancia del ARNm. El estudio presentó los perfiles de expresión de lncRNA, circRNA y mRNA en el tejido del hipocampo de ratones tx-J. Además, el estudio construyó redes de expresión de PPI, ceRNA y CNC. Los hallazgos son significativos para comprender la función de los genes reguladores en WD asociados con el deterioro cognitivo. Estos resultados también ofrecen información valiosa para el diagnóstico y tratamiento de la EW.

La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno autosómico recesivo causado por mutaciones en el transportador de cobre de los conductos biliares ATP7B, que provoca una acumulación excesiva de cobre (Cu) en los tejidos, que fue introducido por Kinnear Wilson en 19121. El gen ATP7B es una ATPasa de tipo P que puede mantener la concentración adecuada de cobre en el cuerpo. Las mutaciones de este gen conducen a la acumulación de cobre en varios tejidos y órganos, incluidos el hígado, el cerebro, la córnea y los riñones2. Así, la presentación clínica de la EW varía desde un estado asintomático hasta hepático, neurológico, oftálmico y psiquiátrico3. La enfermedad hepática puede presentarse como la primera manifestación clínica de la enfermedad de Wilson (EW), con una variedad de síntomas que incluyen enzimas hepáticas elevadas asintomáticas, hepatitis aguda, hepatitis grave, cirrosis compensada/descompensada e incluso insuficiencia hepática aguda4. Después de las manifestaciones hepáticas, los síntomas neurológicos son el síntoma clínico más común, que puede presentarse en diversos grados de trastornos del movimiento como temblor, distonía o parkinsonismo, y disfunciones no motoras como disartria, disfagia, trastornos psiquiátricos, disfunción cognitiva, trastornos de personalidad. , etc.5. El depósito ocular patológico de cobre también puede dar lugar a manifestaciones oftalmológicas típicas de la EW, como los anillos de Kayser-Fleischer y las cataratas en girasol6. Además, el depósito de cobre en el corazón puede provocar arritmias cardíacas, miocardiopatía, etc.; la enfermedad renal puede resultar en disfunción tubular, cálculos renales, hipercalciuria, etc.; el sistema óseo puede manifestarse como osteoporosis, cartílago cálcico, artrosis, etc.; y el aparato reproductor femenino puede presentarse con menstruación irregular, infertilidad, aborto habitual, etc.7. La disfunción cognitiva es el principal síntoma no motor en los sistemas neurológicos. Kirk et al. encontraron que el deterioro cognitivo estaba presente en más de la mitad de los pacientes con EW estable independientemente del fenotipo y persistió en el curso a largo plazo de la enfermedad8. Como una de las pocas enfermedades genéticas congénitas tratables, el diagnóstico temprano y el tratamiento oportuno de la EW podrían facilitar un control efectivo9.

En nuestro estudio, se utilizaron ratones tx-J como modelo animal. Según una investigación realizada por el Laboratorio Jackson, la acumulación de cobre en el hipocampo provocó alteraciones del comportamiento y deterioro de la memoria en ratones tx-J10. Estudios previos también han confirmado que la sobreactivación de la autofagia mitocondrial en las neuronas del hipocampo de ratones tx-J puede conducir a una disfunción cognitiva11. Además, un estudio diferente informó que el 82 % de los humanos y el 91 % de los ratones tx-J comparten la misma secuencia de aminoácidos de la proteína WND, que tiene dominios funcionales que contienen ATPasas transportadoras de cobre12. Por lo tanto, los ratones tx-J son un modelo válido para estudiar WD.

El ARN no codificante es un elemento candente en el campo de la neurociencia actual. Carecen de funciones de codificación de proteínas, mientras que pueden regular la transcripción y la traducción a través de la estructura de la cromatina13, el andamiaje de ARN/proteína, las modificaciones epigenéticas y de esponja, el empalme selectivo, etc.14. La diversidad y complejidad de los ARN no codificantes y las redes de control de genes relacionados juegan un papel vital en la regulación de patologías fisiológicas15. Un estudio que explora los perfiles de expresión génica del envejecimiento del hipocampo encontró que la desregulación de las inmunoglobulinas puede ser un mecanismo potencial del envejecimiento del hipocampo, lo que requiere atención al papel de la inmunidad centrada en el hipocampo en el proceso de envejecimiento16. La secuenciación del transcriptoma completo y el análisis refinado pueden ayudar a identificar y estudiar las funciones de los ncRNA. En comparación, los estudios de ncRNA-miRNA-mRNA ce-network de perfiles de transcriptomas completos en el tejido del hipocampo de ratones tx-J no se informan actualmente.

Este estudio proporciona una descripción de los perfiles de expresión de ARN codificante y no codificante en el tejido del hipocampo de personas con enfermedad de Wilson (EW). Hemos identificado los lncRNA, circRNA y mRNA expresados ​​diferencialmente, y hemos construido una nueva red de interacción proteína-proteína (PPI) y una red de coexpresión. Además, empleamos DE-circRNAs, redes de ceRNA asociadas a lncRNAs y análisis de enriquecimiento de la ruta GO/KEGG para predecir de manera integral sus funciones. Finalmente, utilizamos PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para confirmar la expresión de genes asociados con WD. Nuestros hallazgos contribuyen a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de WD y las estrategias para diagnosticar y tratar el deterioro cognitivo relacionado con WD.

Después de someterse a un programa de entrenamiento de cuatro días, los ratones se sometieron a un experimento de crucero de posicionamiento el quinto día. El experimento consistió en comparar la latencia de escape y la distancia de nado en el cuadrante opuesto a la plataforma entre el grupo WD y el grupo control. Los hallazgos indicaron que el grupo WD tenía valores significativamente más altos que el grupo control, con una diferencia estadísticamente significativa (Fig. 1a,b). Además, la latencia de escape promedio y la distancia total de nado en los tres cuadrantes, excepto en el cuadrante de la plataforma, se compararon entre los dos grupos. Los resultados mostraron que el grupo WD tenía valores más altos que el grupo control, con una diferencia estadísticamente significativa (Fig. 1c, d). Estos resultados sugirieron que, bajo las mismas condiciones de entrenamiento, los ratones tx-J requieren más tiempo y nadan distancias más largas para encontrar la plataforma, lo que indica habilidades de memoria y aprendizaje espacial significativamente más bajas que los ratones normales.

Análisis de habilidades de memoria y aprendizaje espacial realizado a través de pruebas MWM. (a) Latencia de escape del cuadrante de la plataforma opuesta (**P < 0.01). (b) Distancia de nado del cuadrante opuesto de la plataforma (**P < 0.01). ( c ) Latencia de escape promedio de tres cuadrantes excepto el cuadrante de la plataforma (* P <0.05). (d) Distancia total de nado excepto para el cuadrante de la plataforma (*P < 0.05).

Como se muestra en la Fig. 2, los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina mostraron que el hipocampo en las células piramidales del área CA1 de los ratones de control estaba densamente dispuesto y era regular, con núcleos de células piramidales suaves y nervio periférico denso, intercalado con algunas células gliales, buena morfología. , y abundantes capilares. Por el contrario, las células piramidales del hipocampo de los ratones tx-J en el grupo WD se redujeron en número, se organizaron de manera suelta, con intervalos celulares ampliados, niveles de células piramidales muy reducidos, edema leve, citoplasma y núcleos ligeramente teñidos, pérdida de células piramidales localizada, transparente bandas en forma de anillo alrededor de las células y características prominentes de muerte celular (Fig. 2a). Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia mostraron que, en comparación con el grupo de control, la cantidad de nuevas neuronas supervivientes en la circunvolución dentada del hipocampo en el grupo WD se redujo significativamente (Fig. 2b).

Los cambios morfológicos en el hipocampo de dos grupos. ( a ) Los resultados de la tinción con hematoxilina y eosina (× 400). La flecha en la figura muestra que las células piramidales del hipocampo están edematosas, la brecha celular se ensancha y hay una banda transparente en forma de anillo alrededor de ellas y la muerte celular. ( b ) Los resultados de la tinción DAPI, el etiquetado BrdU y la fusión de las neuronas del hipocampo (× 20 μm). La flecha muestra una disminución significativa en el número de neuronas recién formadas en el hipocampo del grupo WD.

Analizamos los ARN de DE utilizando el método EdgeR, siguiendo los criterios P ​​< 0,05 y |log2FC|> 1,5. Se usaron el diagrama de Venn, el gráfico de volcanes y el mapa de agrupamiento para mostrar los ARN DE, como se muestra en la Fig. 3. Las Figuras 3a-c indican el diagrama de Venn, el gráfico de volcán y el mapa de calor de agrupamiento de DEG. La Figura 3d–f muestra el diagrama de Venn, la gráfica del volcán y el mapa de calor de agrupamiento de los DEL. La figura 3g–i indica el diagrama de Venn, el diagrama de volcanes y el mapa de calor de agrupamiento de DEC. La información detallada se muestra en las tablas complementarias S1, S2, S3. En las Tablas 1, 2 y 3 se muestra información detallada sobre los 20 principales DEC/DEL/DEG regulados hacia arriba y hacia abajo en el hipocampo tx-J.

Perfiles de expresión de ARN DE. ( a – c ) Perfiles de expresión de ARNm de DE. ( d – f ) Perfiles de expresión de DE lncRNA. ( g – i ) Perfiles de expresión de DE circRNAs. El diagrama de Venn (a,d,g), que se traza en Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html), muestra el número de ARN DE superpuestos en el grupo WD en comparación con el grupo de control. En los gráficos de volcanes (b,e,h) realizados con las herramientas de OECloud (https://cloud.oebiotech.com), los puntos azules representan los ARN de DE regulados a la baja, mientras que los puntos rojos representan los ARN de DE regulados al alza. En el mapa de calor (c, f, i) realizado con Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/), los rectángulos azules representan una disminución de los ARN de DE y los rectángulos rojos representan un aumento de los ARN de DE.

En general, en comparación con el grupo de control, un total de 361 DE-mRNA (193 de regulación al alza y 168 de regulación a la baja), 2627 DE-lncRNA (1270 de regulación al alza y 1357 de regulación a la baja) y 99 DE-circRNA (68 up-regulation y 31 down-regulation) se identificaron en el hipocampo tx-J.

Dado que se encontró que noventa y nueve circRNA tenían cambios significativos con WD en RNA-seq, se desconoce la confiabilidad de los resultados. Para confirmar la confiabilidad, se seleccionaron aleatoriamente seis circRNA con cambios de pliegue de nivel relativamente alto en RNA-seq para la validación de qRT-PCR, incluidos tres circRNA regulados al alza (mmu_circ_0001700, mmu_circ_0001662 y mmu_circ_00013859) y tres circRNA regulados a la baja (mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 y mmu_circ_0000460). Como se presenta en la Fig. 4, los datos de qRT-PCR muestran que los circRNA mmu_circ_0001700 y mmu_circ_0001662 estaban significativamente regulados al alza, mientras que los circRNA mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 y mmu_circ_0000460 estaban significativamente regulados a la baja en el grupo WD. Estos resultados fueron consistentes con RNA-seq, lo que sugiere que los datos de RNA-seq están disponibles.

Validación qRT-PCR de los candidatos DE-circRNA.

Construimos una red de PPI basada en la interacción de los ARNm de DE con las proteínas que se muestran en la Fig. 5a. La información detallada sobre las interacciones se incluye en la Tabla complementaria S4. Resumimos los diez principales genes fundamentales con los valores de grado más altos, que son Srsf1, Smarca2, Ppp1cc, Tia1, Ngf, Shank3, Ptk2b, Tcf3, Scn1a e Ikzf.

Visualizaciones de red PPI y análisis de enriquecimiento funcional de DEGs. (a) La red PPI se identificó utilizando Cytoscape (v3.9.1). Cuanto mayor sea el valor del grado, más oscuro será el color. (b) Los análisis de enriquecimiento GO de DEG se realizaron utilizando las herramientas OECloud (https://cloud.oebiotech.cn). (c) Los análisis de enriquecimiento KEGG de DEG se realizaron utilizando las herramientas OECloud. ( d ) Se realizaron análisis de enriquecimiento de REactoma de DEG utilizando las herramientas OECloud.

Análisis GO enriquecidos en procesos biológicos que incluyen la organización del citoesqueleto de microtúbulos (GO: 0000226), hemopoyesis (GO: 0030097) y desarrollo de proyección neuronal (GO: 0031175), el componente celular que incluye citoesqueleto (GO: 0,005,856), citoplasma (GO: 0005737) , y sinapsis (GO: 0045202), función molecular que incluye la actividad del activador de la proteína tirosina quinasa del receptor transmembrana (GO: 0030297), unión a proteínas (GO: 0005515) y unión a haptoglobina (GO: 0031720) (Fig. 5b). Vías KEGG enriquecidas en vía de vigilancia de ARNm (mmu03015), vía de señalización de calcio (mmu04020), tripanosomiasis africana (mmu05143) y sinapsis dopaminérgica (mmu04728) et al. (Figura 5c). El enriquecimiento del reactoma se mostró en la Fig. 5d, como p75NTR recluta complejos de señalización (R-MMU-209543), NF-kB se activa y señala la supervivencia (R-MMU-209560) y NRIF señala la muerte celular del núcleo (R- MMU-205043). Todos los resultados de enriquecimiento se mostraron en la Tabla complementaria S5.

En la figura 6 se muestran dos KEGG relacionados con la neurofisiología y la patología del hipocampo, con los DEG indicados, incluido el potencial a largo plazo (mmu04720) (figura 6a) y la sinapsis glutamatérgica (mmu04724) (figura 6b).

Dos KEGG relacionados con la neurofisiología y la patología del hipocampo y los DEG se indicaron entre comillas de la base de datos KEGG (www.kegg.jp/feedback/copyright.html). (a) Potencial a largo plazo (mmu04720); (b) Sinapsis glutamatérgica (mmu04724). El verde representa la regulación a la baja del gen, mientras que el rojo representa la regulación al alza del gen.

Las redes reguladoras competitivas de ARN endógeno (ARNce) desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades humanas. Construimos una red reguladora triple circRNA-miRNA-mRNA y lncRNA-miRNA-mRNA basada en los ncRNA expresados ​​diferencialmente anteriores. Las partes funcionales y los mecanismos potenciales de esta red se evaluaron mediante análisis de enriquecimiento funcional.

En este estudio, obtuvimos 75 circRNA diferenciales, 1216 miRNA y 333 mRNA en la red reguladora de ceRNA relacionada con circRNA, como se muestra en la Fig. 7a. Cinco circRNA, incluidos circRNA.1742, circRNA.3006, circRNA.4795, circRNA.7584 circRNA.9442, se consideraron como posibles circRNA centrales, y 11 miRNA, incluidos mmu-miR-149-3p, mmu-miR-1946a, mmu- miR-1946b, mmu-miR-328-5p, mmu-miR-3470a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473b, mmu-miR-3473d, mmu-miR-3547-5p, mmu-miR-6931- 5p y mmu-miR-7045-3p se consideraron miARN clave (Fig. 7b-d). Derivamos pares de genes de ceRNA relacionados, como circRNA 7584/mmu-miR-1946a/Cacna1i, circRNA 7817/mmu-miR-6931-5p/Fosb, etc. Se proporcionó información específica sobre las redes de ceRNA relacionadas con circRNA en la Tabla complementaria S6, y la información detallada sobre 12 algoritmos se incluyó en la Tabla complementaria S7.

La construcción de redes circRNA-miRNA-mRNA ceRNA mostradas por Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Redes de ceRNA asociadas a CircRNA. Los nodos de diamante rojo representan circRNA significativamente diferenciales, los nodos de rectángulo azul representan sus miRNA predichos y los nodos de elipse rosa representan los mRNA predichos. ( b ) Los 10 genes centrales principales en la red ceRNA se calcularon mediante el método de grado. ( c ) Los 10 principales genes centrales en la red ceRNA se calcularon mediante el método EPC. ( d ) Los 10 principales genes centrales en la red ceRNA se calcularon mediante el método MCC.

En la Fig. 8a se muestra una red de ceRNA asociada a lncRNA que contiene 2337 lncRNA, 113 miRNA y 330 mRNA, y el mapa de red que contiene los 500 genes principales. Después del cálculo, ENSMUST00000145250, ENSMUST00000180800, NONMMUT015424.2 se consideró como el lncRNA central, mmu-miR-1195, mmu-miR-1893, mmu-miR-1946a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473d, mmu-miR -3620-3p, mmu-miR-3960, mmu-miR-5126, mmu-miR-6931-5p se consideraron miARN concentrador (Fig. 8b-d). Identificamos varios pares de genes ceRNA que pueden tener funciones críticas, como NONMMUT115700.1/mmu-miR-3473d/Mob1b, NONMMUT015424.2/mmu-miR-5126/AL592169.1, ENSMUST00000180800/mmu-miR-5126/Shank3, etc. La información específica sobre las redes de ceRNA relacionadas con lncRNA se proporcionó en la Tabla complementaria S8, y la información detallada sobre 12 algoritmos se incluyó en la Tabla complementaria S9.

La construcción de redes lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA mostradas por Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Redes de ceRNA asociadas a LncRNA. Los nodos del triángulo púrpura representan lncRNA significativamente diferenciales, los nodos del rectángulo redondo naranja representan los miRNA predichos y los nodos del hexágono gris oscuro representan los mRNA predichos. ( b ) Los 10 genes centrales principales en la red ceRNA se calcularon mediante el método de coeficiente de agrupación. ( c ) Los 10 principales genes centrales en la red ceRNA se calcularon mediante el método EPC. ( d ) Los 10 principales genes centrales en la red ceRNA se calcularon mediante el método Stress.

Realizamos un análisis de enriquecimiento GO/KEGG apuntando por separado a los mRNA en dos redes de ceRNA. La red de enriquecimiento funcional de ARNm dirigidos a ceARN asociado a circRNA se muestra en la Fig. 9a. Los resultados de GO y KEGG del enriquecimiento funcional de ARNm regulado negativamente se demostraron en la Fig. 9b, c. Análisis GO (Fig. 9b) enriquecidos en unión celular (GO: 0030054), proyección celular (GO: 0042995), sinapsis (GO: 0045202), vesícula citoplasmática (GO: 0031410) y análisis KEGG (Fig. 9c) enriquecidos en Adicción a las anfetaminas (mmu05031), señalización adrenérgica en cardiomiocitos (mmu04261), unión estrecha (mmu04530), etc. Los resultados de GO y KEGG del enriquecimiento funcional de ARNm regulado al alza se demostraron en la Fig. 9d, e. Análisis GO (Fig. 9d) enriquecidos en citoplasma (GO: 0005737), unión a proteínas (GO: 0005515), núcleo (GO: 0005634), unión a iones metálicos (GO: 0046872) y análisis KEGG (Fig. 9e) enriquecidos en Vía de señalización Ras (mmu04014), vía de señalización PI3K-Akt (mmu04151), infección por Salmonella (mmu05132), etc. Los resultados del enriquecimiento se muestran en la Tabla complementaria S10.

Análisis de redes de enriquecimiento de mRNA dirigidos a circRNA analizados con las herramientas de OECloud (https://cloud.oebiotech.com). ( a ) La red de enriquecimiento funcional de ARNm dirigidos a ceARN asociado a circRNA. ( b, c ) El número de genes en el término GO / KEGG de ARNm regulados a la baja dirigidos a circARN. ( d, e ) El número de genes en el término GO / KEGG de mRNA regulados al alza dirigidos a circRNA en el hipocampo de ratones tx-J.

La red de enriquecimiento funcional de los ARNm dirigidos a ceARN asociados con lncRNA se muestra en la Fig. 10a. Los resultados de GO/KEGG del enriquecimiento funcional de ARNm regulado negativamente se demostraron en la Fig. 10b,c. Análisis GO (Fig. 10b) enriquecidos en actividad de oxidorreductasa (GO: 0016491), unión de iones de calcio (GO: 0005509), movimiento basado en microtúbulos (GO: 0007018), microtúbulos (GO: 0005874), membrana plasmática apical (GO: 0016324 ), y análisis KEGG (Fig. 10c) enriquecidos en Vías de neurodegeneración-múltiples enfermedades (mmu05022), enfermedad de Huntington (mmu05016), interacción neuroactiva ligando-receptor (mmu05014), etc. Los resultados GO y KEGG de ARNm funcional regulado al alza el enriquecimiento se demostró en la Fig. 10d, e. Análisis GO (Fig. 10d) enriquecidos en la regulación de la producción de citocinas (GO: 0001817), proceso metabólico xenobiótico (GO: 0006805), complejo de ubiquitina ligasa (GO: 0000151) y análisis KEGG (Fig. 10e) enriquecidos en proteólisis mediada por ubiquitina (mmu04120), Vías de neurodegeneración-múltiples enfermedades (mmu05022), etc. Todos los resultados de enriquecimiento se mostraron en la Tabla complementaria S11.

Análisis de redes de enriquecimiento de mRNA dirigidos a lncRNA analizados con las herramientas de OECloud (https://cloud.oebiotech.com). ( a ) La red de enriquecimiento funcional de ARNm dirigidos a ceRNA asociado a lncRNA. ( b, c ) El número de genes en el término GO / KEGG de mRNA regulados a la baja dirigidos a lncRNA. ( d, e ) El número de genes en el término GO / KEGG de mRNA regulados al alza dirigidos a lncRNA en el hipocampo de ratones tx-J.

Con base en el coeficiente de correlación de Pearson |r|> 0.7 y el P <0.05, obtuvimos 2051 pares de genes coexpresados ​​​​con ARNm-circRNA, incluidos 92 circRNA y 397 mRNA, como se muestra en la Fig. 11a. Entre ellos, los cinco circRNA con la correlación más alta incluyen "circRNA.1641", "circRNA.2061", "circRNA.4258", "circRNA.4898", "circRNA.7366", "circRNA.7621". Las subredes basadas en algoritmos se muestran en la Fig. 11b–d. La información sobre los pares circRNA-mRNA se mostró en la Tabla complementaria S12, y la información detallada sobre 12 algoritmos se incluyó en la Tabla complementaria S13.

Visualizaciones de red y subredes de coexpresión de circRNA-mRNA mostradas por Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Red de coexpresión CircRNA-mRNA. Los nodos de diamantes rojos representan circRNAS. Los nodos de eclipse rosa representan ARNm. ( b ) Los 10 principales genes centrales en la red de coexpresión circRNA-mRNA se calcularon mediante el método MCC. ( c ) Los 10 principales genes centrales en la red de coexpresión circRNA-mRNA se calcularon mediante el método Radiality. ( d ) Los 10 principales genes centrales en la red de coexpresión circRNA-mRNA se calcularon mediante el método Stress.

Construimos una red de coexpresión de lncRNA-mRNA en el mismo umbral con 2627 lncRNA y 361 mRNA en la Fig. 12a. Identificamos ocho lncRNA como lncRNA cruciales, incluidos "MSTRG.18029.6", "MSTRG.24543.1", "NONMMUT014183.2", "NONMMUT059281.2", "NONMMUT072370.2", "NONMMUT072383.2", "NONMMUT147148.1" , "NONMMUT148168.1". Las subredes basadas en los tres algoritmos se muestran en la Fig. 12b–d. La información sobre el par de genes lncRNA-mRNA se incluyó en la Tabla complementaria S14, y la información detallada sobre 12 algoritmos se incluyó en la Tabla complementaria S15.

Visualizaciones de red y subredes de coexpresión de lncRNA-mRNA mostradas por Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Red de coexpresión de LncRNA-mRNA. Los nodos del triángulo morado representan lncRNA. Los nodos hexagonales de color gris oscuro representan ARNm. (b) El método Closeness calcula los mapas de expresión de los 10 principales genes hub en la red de coexpresión lncRNA-mRNA. ( c ) El método EPC calcula los mapas de expresión de los 10 genes centrales principales en la red de coexpresión lncRNA-mRNA. ( d ) El método Stress calcula los mapas de expresión de los 10 principales genes centrales en la red de coexpresión circRNA-mRNA.

El trabajo actual es el primer análisis transcriptómico de circRNAs, lncRNAs y mRNAs en el hipocampo del modelo de ratón tx-J de WD. En estos modelos, los circRNA, lncRNA y mRNA expresados ​​diferencialmente están asociados con los mecanismos por los cuales se produce el deterioro cognitivo en WD. Nos centramos en los componentes participantes de los ARN no codificantes en la red ceRNA y sus efectos sobre las funciones celulares. Analizamos la implicación característica de los ARN no codificantes en las redes de ceRNA que regulan el deterioro cognitivo en la EW, lo que contribuye a explorar biomarcadores para el diagnóstico o pronóstico del deterioro cognitivo en la EW a nivel molecular.

Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que la transcripción del ARN y los cambios en el metabolismo son fundamentales para desarrollar síntomas y enfermedades complejos. Los RNA no codificantes representan la mayor parte del transcriptoma del organismo, abundante en el sistema nervioso central e intensamente involucrado en la regulación transcripcional de los RNA, siendo así asociado a los mecanismos de muchos síntomas y enfermedades neurológicas17. Varios estudios han demostrado que los ARN codificantes y no codificantes regulan la transcripción a través de la unión de miARN y, por lo tanto, afectan la expresión del gen objetivo aguas abajo, lo que se conoce como un mecanismo de ARN endógeno competitivo18. Este patrón de regulación génica se puede utilizar para explicar la complejidad de las especies o fenotípicas19.

Los estudios han demostrado que hasta el 60 % de los pacientes con EW tienen síntomas neurológicos o psiquiátricos en el momento de la presentación20, incluidos déficits motores, cognitivos y conductuales, y que la disfunción cognitiva persistente o progresiva está presente, incluso en pacientes tratados con "desintoxicación de cobre" y pacientes con o sin acumulación cerebral de cobre21. Como se mencionó anteriormente, los ratones tx-J son actualmente un modelo ideal para estudiar la secuenciación del transcriptoma de WD y fenotipos relacionados. En este estudio, confirmamos la presencia de deterioro cognitivo en ratones tx-J a través de una prueba de laberinto de agua, incluida la disminución de las capacidades de memoria y aprendizaje espacial. Mientras tanto, con respecto al examen morfológico de las estructuras del hipocampo, los ratones modelo tx-J mostraron destrucción de las células neuronales en la región de la circunvolución dentada del hipocampo. Disminuyeron significativamente el número de nuevas células neuronales. Indica que existe un deterioro cognitivo detectable en ratones tx-J en comparación con los controles. Por un lado, esta evidencia de deterioro cognitivo puede mejorar la cientificidad de los modelos animales y fortalecer la confiabilidad de los resultados de la secuenciación.

En este estudio, realizamos el análisis de expresión diferencial de mRNA\circRNA\lncRNA, construimos una red de expresión de PPI y la red de ceRNA relacionada con ncRNA y la red de coexpresión de ncRNA/mRNA en el tejido del hipocampo de ratones modelo WD tx-J para la primera vez. Proyectamos 361 DEG. Muchos de estos genes diana expresados ​​de manera significativamente diferencial están estrechamente asociados con la patología del deterioro cognitivo. Descubrimos que algunos ARNm a los que se dirigen los miARN en las redes reguladoras de ARNce asociadas a ncARN también se expresaron diferencialmente, como Fosb, Shank3 y Cacna1i, etc.

Fosb es un factor de transcripción dependiente de la actividad que se acumula y se retiene durante la actividad celular crónica debido a su larga vida media22. Fosb juega un papel fundamental en la regulación de la memoria del hipocampo; Los estudios han confirmado que la familia Fosb regula muchos objetivos relacionados con la adicción de genes objetivo cruciales a través de modificaciones de histonas23. También se ha demostrado que la sobreexpresión de Fosb en el hipocampo puede afectar el aprendizaje y la memoria24. Un estudio que examina la regulación de Fosb de la expresión génica en ratones modelo AD con disfunción cognitiva sugiere que Fosb puede suprimir la expresión de c-Fos, un gen temprano crítico para la plasticidad y la cognición, al unirse a promotores y desencadenar la desacetilación de histonas y que la mitad larga vida de Fosb lo convierte en una posible causa de la persistencia de los déficits cognitivos25. Como proteína de andamiaje postsináptica excitatoria, SHANK3 actúa sobre varias proteínas de densidad postsináptica para regular los receptores de neurotransmisores postsinápticos y las moléculas de señalización26. Un estudio basado en la predicción de niveles de variantes de un solo gen en el trastorno del espectro autista (TEA) mostró que los niveles de ARNm de SHANK3 afectan la transmisión sináptica en el hipocampo de ratones, lo que lleva a una posible depresión a largo plazo y a un deterioro a largo plazo del aprendizaje y la memoria27. Se encontró que el gen del canal de calcio (Cav) dependiente de voltaje CACNA1I (Cav3.3) se considera un factor de riesgo para la esquizofrenia y que las variantes en este gen conducen a la interrupción de la excitabilidad neuronal y la actividad de la red cerebral, afectando procesos como la liberación del transmisor. , sensación, memoria y sueño28.

El ARN no codificante es una clase de moléculas de ARN que no codifican proteínas y representan aproximadamente el 98-99 % del ARN total en los genomas de mamíferos29. Cada vez hay más pruebas de que los ARN no codificantes desempeñan funciones reguladoras importantes al interactuar activamente con otras moléculas; por ejemplo, un ARN no codificante interactúa con una o más moléculas diana para regular células o vías para afectar procesos fisiológicos o patológicos normales, incluida la regulación de enfermedades neurológicas30. Los CircRNA son una clase de moléculas cíclicas monocatenarias cerradas covalentemente sin capuchones en 5' ni colas poliadeniladas en 3'31, que son estables, abundantes y conservadas32 y tienen un potencial único para la investigación médica. En este estudio, identificamos el perfil de circRNAs en el tejido del hipocampo con WD, y se descartaron 99 DEC significativos. En particular, mmu_circ_0001859 y mmu_circ_0000242 estaban fuertemente relacionados con la guía del axón, la vía de señalización de Wnt, la vía de señalización del calcio, la vía de señalización de MAPK, la adhesión focal, la vía de señalización de neurotrofina, la vía de señalización de TGF-beta, el ciclo celular, la vía de señalización de ErbB, la vía de señalización de Notch, p53 vía de señalización, fagocitosis mediada por Fc gamma R, etc.

Los estudios han confirmado las funciones biológicas de los circRNA, como participar en la regulación transcripcional en el núcleo, actuar como adsorbentes endógenos de miRNA, moldes para la traducción de proteínas o péptidos y reguladores de la expresión génica33. CircRNA es excepcionalmente abundante en el cerebro de los mamíferos, que está regulado al alza a nivel general durante la diferenciación neuronal, altamente enriquecido en neurosinapsis y juega un papel vital en el desarrollo de trastornos neuropsiquiátricos34. Un estudio basado en el análisis profundo de secuencias de ARN aclaró sistemáticamente el mecanismo de ceARN asociado con circARN craneal en un modelo de ratón con AD (ratones APP/PS1) y descubrió que la red de ceARN asociada a circARN en este modelo de ratón está principalmente involucrada en el desarrollo y la memoria dendríticos ( Sorbs2) y el neurodesarrollo del ratón (ALS2), que aporta nuevas ideas para el diagnóstico clínico y el tratamiento de la EA35. La primera exploración de los perfiles de expresión de circRNA del hipocampo en ratones envejecidos con POCD sugiere que la red de ceRNA mmu_circRNA_22058 y circRNA_44122\Egfr o la red de ceRNA circRNA_22673\Prkacb pueden tener una participación significativa en el curso de la enfermedad de POCD36. En este estudio, identificamos 99 circRNA expresados ​​significativamente de manera diferencial en el tejido del hipocampo de ratones tx-J modelo WD en comparación con los controles. Construimos una red de ceRNA basada en circRNA expresados ​​diferencialmente y realizamos un análisis de enriquecimiento funcional. Realizamos análisis GO y KEGG en genes regulados hacia arriba y hacia abajo de redes de ARNce asociadas a circRNA respectivamente, e identificamos una serie de términos enriquecidos asociados con enfermedades neurológicas y procesos cognitivos. En nuestros resultados, GO de genes regulados positivamente se enriqueció en el citoplasma (GO: 0005737), unión a proteínas (GO: 0005515), núcleo (GO: 0005634) y unión a iones metálicos (GO: 0046872). Por el contrario, KEGG se enriqueció en la vía de señalización de Ras (mmu04014), la vía de señalización de PI3K-Akt (mmu04151), la vía de señalización de Calcium (mmu04020), etc. GO de los genes regulados a la baja se enriquecieron en la unión celular (GO: 0030054), proyección celular (GO: 0042995), sinapsis (GO: 0045202) y vesícula citoplasmática (GO: 0031410), y KEGG se enriqueció en Adicción a la anfetamina (mmu05031), Señalización adrenérgica en cardiomiocitos (mmu04261), Unión estrecha (mmu04530), Circadian arrastre (mmu04713). Identificamos varias redes de ceRNA que pueden contribuir a la progresión del deterioro cognitivo en WD. Por ejemplo, en la red ceRNA con mmu-miR-6931-5p como núcleo y Fosb como gen diana, los 44 circRNA aguas arriba pueden unirse a mmu-miR-6931-5p como una esponja para regular la expresión de los genes diana Fosb.

A diferencia de los circRNA, los LncRNA tienen más de 200 nucleótidos de longitud y tienen extremos 5' y colas multiméricas en el extremo 3', de modo que se reconocen fácilmente mediante la secuenciación de ARN basada en oligonucleótidos37. La expresión de lncRNA en el cerebro es específica de tejido38, y los estudios han confirmado la presencia de patrones de expresión regionales y específicos de células de lncRNA en regiones cerebrales de memoria cognitivamente relevantes como el hipocampo, la corteza prefrontal y la amígdala39, como lncRNA Gm9968, que está significativamente enriquecido en el tejido del hipocampo de ratón, juega un papel importante en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer y la epilepsia. Se han demostrado muchos lncRNA con relevancia cognitiva en modelos in vivo o in vitro. Por ejemplo, LncRNA Rian puede reducir la expresión de LIMK1 al regular negativamente miR143-3p. Así, la modulación del eje LncRNA Rian/miR143-3p/LIMK1 puede mejorar la disfunción cognitiva tras la anestesia con sevoflurano40. Un estudio sobre el mecanismo de acción de LncRNA MEG3 sobre la función cognitiva en ratas modelo con AD mostró que la regulación positiva de LncRNA MEG3 inhibió el daño neuronal, redujo la expresión positiva de Aβ y mejoró los índices inflamatorios en ratas con AD, mejorando también la función cognitiva41. En modelos de ratón con deterioro cognitivo vascular, LncRNA TUG1 puede unirse e interactuar con las proteínas BDNF, y su sobreexpresión puede provocar disfunción cognitiva en ratones después de VCI42. Identificamos 2627 DEL en el tejido del hipocampo de ratones tx-J modelo WD y realizamos un análisis de enriquecimiento funcional en los ceRNA asociados a lncRNA construidos. Entre ellos, los genes diana regulados al alza GO se enriquecieron en la regulación de la producción de citoquinas (GO: 0001817), proceso metabólico xenobiótico (GO: 0006805), complejo de ubiquitina ligasa (GO: 0000151), endosoma tardío (GO: 0005770), ubiquitina- actividad enzimática de conjugación (GO: 0061631), actividad correpresora de la transcripción (GO: 0003714), enriquecimiento de KEGG en proteólisis mediada por ubiquitina (mmu04120), Vías de neurodegeneración: múltiples enfermedades (mmu05022). La expresión regulada a la baja de genes diana GO está enriquecida en actividad de oxidorreductasa (GO: 0016491), unión de iones de calcio (GO: 0005509), movimiento basado en microtúbulos (GO: 0007018), microtúbulos (GO: 0005874), membrana plasmática apical (GO : 0016324), cilio (GO: 0005929). El análisis KEGG está enriquecido en Vías de neurodegeneración: múltiples enfermedades (mmu05022), enfermedad de Huntington (mmu05016), esclerosis lateral amiotrófica (mmu05014), interacción neuroactiva ligando-receptor (mmu04080). Por ejemplo, en la red ceRNA dirigida a SHANK3, el lncRNA NONMMUT015424.2 superior (lncRNA D130020L05Rik) puede usar mmu-miR-5126 como una esponja para regular la expresión transcripcional de SHANK3 uniéndose a él. Nuestro modelo de red de ncRNA-ceRNA predicho puede contribuir al desarrollo de deterioro cognitivo en WD, y la función de estas redes requiere una mayor validación experimental.

El estudio presentado en este artículo tiene varias limitaciones. En primer lugar, el pequeño tamaño de la muestra puede limitar la generalización de los resultados. Además, los resultados obtenidos a partir de modelos animales pueden no ser completamente representativos del perfil transcripcional de todos los fenotipos de la enfermedad de Wilson (EW), incluidos los ratones hembra y los pacientes humanos. En segundo lugar, la evaluación del aprendizaje espacial y la memoria en ratones puede no haber sido lo suficientemente completa. Además, este estudio investigó únicamente el perfil transcripcional del hipocampo en el modelo animal WD, y no se examinaron otros tejidos de deposición de cobre, lo que significa que no fue posible investigar la expresión génica en diferentes tejidos. Además, los resultados del estudio carecen de validación experimental, incluidos genes con diferencias de expresión significativas y modelos de redes predictivos, lo que requiere experimentos sólidos para proporcionar evidencia de los resultados. Aunque nuestro estudio arroja luz sobre los mecanismos del deterioro cognitivo en WD basado en la transcriptómica, reconocemos que el mecanismo de regulación de la expresión de las moléculas de transcripción es complejo y requiere más investigación, como la regulación de la modificación epigenética.

En conclusión, investigar los mecanismos fenotípicos patológicos de las enfermedades es una tarea desafiante y que requiere mucho tiempo. Sin embargo, el avance de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento ha facilitado significativamente la exploración de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades. Nuestro examen de la red de interacción proteína-proteína (PPI) y la red de ARN endógeno que compite con el ARN no codificante (ncRNA-ceRNA) en el tejido del hipocampo de ratones tx-J, un modelo de la enfermedad de Wilson (WD), tiene implicaciones importantes para identificar biomarcadores potenciales y valores objetivo esenciales para diagnosticar, tratar y desarrollar fármacos para el deterioro cognitivo en la EW.

El estudio utilizó diez ratones machos tx-J (C3HeB/FeJ-Atp7b tx-J/J) que pesaban 20 ± 2 g y diez ratones machos de tipo salvaje (C3HeB/FeJ) de 8 a 10 semanas de edad, adquiridos del Laboratorio Jackson a través de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology, Ltd. Todos los ratones se alojaron individualmente en jaulas con humedad controlada (50–70 %), temperatura ambiente (18–22 °C) y suministro de aire separado, con acceso ad libitum a comida y agua bajo un ciclo alternado de luz/oscuridad de 12 h durante ocho semanas. Para este estudio, hubo una superposición de subgrupos de animales; tres de los cuatro ratones tx-J se sometieron a secuenciación de alto rendimiento después de la prueba MWM, cuatro de los siete ratones restantes se sometieron a pruebas de histopatología del hipocampo y los tres restantes se sometieron a experimentos qRT-PCR. Los ratones de tipo salvaje también se trataron de acuerdo con este protocolo. Se ha demostrado que el estrógeno influye en la neuroplasticidad en varias regiones del cerebro, regula y media las sinapsis neuronales y la formación del hipocampo, y afecta el aprendizaje y la memoria43. Por lo tanto, se eligieron ratones macho como sujetos de investigación para minimizar estos efectos.

Los métodos utilizados en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de las directrices ARRIVE2.044. El Comité de Ética de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Anhui revisó y aprobó el protocolo de uso de animales (Número de permiso: AHUCM-mouse-2021125).

El experimento del laberinto de agua de Morris se utiliza habitualmente para evaluar el aprendizaje espacial y las capacidades de memoria en roedores, que consistía en una piscina circular negra (50 cm de alto y 90 cm de diámetro) llena con agua de 45 cm de alto a 21–23 °C y mezclada con un tinte blanco, no tóxico e inodoro, en el que una mesa circular negra se fija 1 cm bajo el agua en el centro del cuarto cuadrante. Se seleccionaron cuatro ratones de cada uno de los dos grupos para el experimento. En el experimento de navegación de posicionamiento, los dos grupos de ratones se pusieron en el agua desde la posición de un ángulo de 45° frente a la pared de la piscina en cualquiera de los cuatro cuadrantes este, oeste, sur y norte y se probaron cuatro veces al día. Si los ratones subieron a la plataforma oculta dentro de los 60 s y permanecieron en la plataforma durante más de 5 s, se consideró que habían encontrado la plataforma. El tiempo desde la entrada del agua hasta el hallazgo de la plataforma se registró como la latencia de escape. Si los ratones no encontraban la plataforma dentro de los 60 s, eran guiados a la plataforma y permanecían allí durante 10 s, y la latencia de escape se registraba como 60 s. Compare la latencia de escape del cuadrante de plataforma opuesto, la latencia de escape promedio de tres cuadrantes excepto el cuadrante de plataforma, la distancia de nado del cuadrante de plataforma opuesto y la distancia de nado total excepto el cuadrante de plataforma en el quinto día entre los dos grupos .

Se seleccionaron cuatro ratones de cada grupo para la histopatología del hipocampo. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (2 ml/kg; Shanghai Chemical Reagent Company) después de ayunar durante 12 h y se extrajeron tejidos de hipocampo bilaterales, se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se deshidrataron en etanol y xileno, se incluyeron en parafina transparente, se seccionaron y retrasado, teñido con hematoxilina-eosina, más deshidratado y sellado, y observado bajo un microscopio óptico.

Después de aislar el tejido del hipocampo en los grupos WD y de control en cajas de hielo, realizamos una secuenciación profunda de muestras de ARN de ribosomas del hipocampo de tres ratones de control y tres tx-J.

El ARN total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se preparó utilizando el kit MiRNeasy Mini (Qiagen, Alemania). Posteriormente, se usaron el kit RNA Clean XP (n.º de catálogo A63987, Beckman Coulter, EE. UU.) y el conjunto de DNasa sin ARNasa (n.º de catálogo 79254, Qiagen, Alemania) para purificar el ARN total. El ARN purificado se cuantificó utilizando dos instrumentos para detectar el contenido y la calidad del ARN: NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, EE. UU.). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las bibliotecas se prepararon utilizando el kit de preparación de muestras de ARN total de cadena truseq® (Illumina, EE. UU.). Se utilizó un fluorómetro Qubit 2.0 para cuantificar la biblioteca. Además, estas bibliotecas fueron verificadas por Agilent 2100 Bioanalyzer. Después de confirmar el tamaño y la concentración molar del fragmento insertado, las bibliotecas se diluyeron a 10 pm con CBOT para generar grupos y se secuenciaron en Illumina HiSeq 2500 (Illumina, EE. UU.). La biblioteca se construyó y secuenció en OG Biotech Inc (Aoji Biotech, Shanghai, China).

Mediante el uso de FastQC (v. 0.11.3, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)45, se cuantificaron las lecturas de RNA-Seq. Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) elimina la secuencia del adaptador de Illumina TruSeq, las lecturas de ARN ribosomal mm10 y las lecturas de baja calidad. Luego, utilizando Hisat2 (versión: 2.0.4), las lecturas recortadas se asignaron al genoma de referencia del ratón (mm10) descargado de Ensembl. StringTie (versión 1.3.0) detectó el recuento de cada gen en las lecturas alineadas. Con secuencia de comandos Perl, se realizó la normalización de recuentos de genes y fragmentos por kilobase de transcripción por millón de lecturas mapeadas (FPKM).

Para los circRNA, todos los datos de secuenciación válidos se procesaron mediante los siguientes pasos: 1) Los datos se alinearon con el genoma del ratón (http://genome.ucsc.edu/)46 mediante el software BWA-MEM (versión: 2.0.4); 2) Se descartaron las lecturas que estaban alineadas contiguamente a los genomas; 3) Las lecturas no mapeadas se analizaron explícitamente en busca de sitios de unión de empalme posterior utilizando algoritmos CIRI para identificar los posibles circRNAs47 y los recuentos se normalizaron mediante SRPBM (Spliced ​​Reads Per Billion Mapping). Los genes que generan circRNA individuales se identificaron haciendo coincidir las ubicaciones genómicas de los circRNA con las detectadas por TopHat/Cufflinks utilizando herramientas BED48. La conservación de circRNA entre humanos y ratones se analizó utilizando la herramienta UCSC Liftover. Se utilizó para mapear las coordenadas de los flancos 3' y 5' de cada circRNA desregulado con las coordenadas del genoma humano. El criterio de homología fue detectar los sitios de empalme dentro de una distancia de ± 2 nucleótidos alrededor de los sitios humanos putativos49.

Para la identificación de lncRNA, se ensamblaron lecturas emparejadas de un solo carril de 2 × 150 pb (PE150) de longitud utilizando el software de ensamblaje de transcripción StringTie para eliminar los mRNA conocidos y las transcripciones < 200 pb de longitud. El software de predicción: Calculadora de potencial de codificación (https://github.com/biocoder/cpc) y Coding Non-Coding Index (https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI#install-CNCI) para la predicción de lncRNA de las transcripciones restantes luego se filtraron del conjunto de datos lncRNA. Los niveles de expresión de lncRNA se midieron por fragmentos por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas mapeadas (FPKM), y la abundancia de expresión de genes conocidos en diferentes muestras se calculó a partir de valores de FPKM.

Se utilizó el método EdgeR para determinar los genes expresados ​​diferencialmente, P < 0,05 y |log2FC|> 1,5. El diagrama de Venn se traza en Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)50. El mapa de volcanes se realizó con las herramientas de OECloud en https://cloud.oebiotech.com. El mapa de calor se realizó en Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/)51.

Se realizó qRT-PCR en tiempo real en el siguiente sistema de reacción: 3,6 μL de H2O libre de RNasa, 0,2 μL de cebador directo (5 μM), 0,2 μL de cebador inverso (5 μM), 1 μL de plantilla de ADNc y 5 μL de supermezcla verde SYBR (Abclonal, Wuhan, China) a 95 °C durante 30 s, seguido de 15 s de reacción, y luego reaccionó a -60 °C durante 15 s y 70 °C durante 15 s, ciclando 40 veces. Los cebadores fueron diseñados y sintetizados por OG Biotech Inc (Aoji Biotech, Shanghai, China). Los niveles de expresión relativos de los circRNA se representaron como 2−∆∆CT.

La base de datos STRING (https://cn.string-db.org/) es una base de datos integrada que brinda información sobre las interacciones proteína-proteína, que no solo incluye interacciones experimentales sino también interacciones predichas, que se utilizó para predecir la interacción de DE ARNm con proteínas. Cytoscape (v3.9.1) se utiliza para construir la red PPI. Usando el complemento MCAO con los conjuntos estándar, los módulos de la red PPI se identificaron con Cytoscape. El análisis de enriquecimiento de la ruta GO y KEGG se realizó con las herramientas OECloud (https://cloud.oebiotech.cn). Visualice los DEG y las rutas relacionadas a través del sitio web de Pathview (https://pathview.uncc.edu/).

Todas las secuencias de miARN derivados de ratones se obtuvieron de miRBase versión 2152. El software personalizado de OG-Biotech, que se basa en el software miRanda y RNAhybrid, se adoptó para predecir objetivos de miARN que pueden interactuar con los DEC y DEL.

Se contó el número de miARN de unión previstos para todos los circARN. El objetivo de ARNm para los miARN de unión previstos se obtuvo de la base de datos miRdana53, targetScan54 y mirTarbase55. El Venny se empleó para obtener un objetivo de ARNm fuertemente respaldado predicho por al menos dos bases de datos. Los DEC y los ARNm que comparten el mismo sitio de unión de miARN representan interacciones circARN-miARN-ARNm.

Para el papel que actúa en cis de los lncRNA que actúan sobre los genes diana vecinos, se buscaron genes codificantes 10 kb/100 kb corriente arriba y corriente abajo del lncRNA y se analizaron sus funciones. Para el papel de acción trans del lncRNA, identificado en función del nivel de expresión, la correlación expresada entre los lncRNA y los genes codificantes se calculó con la función R "prueba cor.". La red ceRNA se mostró visualmente mediante el software Cytoscape.

Los genes centrales se calculan y muestran utilizando los algoritmos relevantes en el complemento Cytohubba56. Estos 12 algoritmos incluyen Grado, Componente Percolado de Borde (EPC), Componente de Vecindad Máxima (MNC), Densidad de Componente de Vecindad Máxima (DMNC), Centralidad de Camarilla Máxima (MCC) y seis centralidades (Cuello de botella, EcCentricidad, Cercanía, Radialidad, Intermediación, y estrés) basado en las rutas más cortas y el coeficiente de agrupamiento. Todos los algoritmos y los diagramas de red resultantes se presentan en las figuras complementarias. S1 y S2.

Para el análisis GO, se realizaron los análisis de proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). Para comprender mejor la función de los DE circ-/lnc-/mRNA, se analizaron las rutas enriquecidas de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizando las herramientas de OECloud (https://cloud.oebiotech.com) para revelar la función de alto nivel y la utilidad del transcriptoma de ratones tx-J, como células, organismos y ecosistemas. Los términos de enriquecimiento significativos para GO y las vías se seleccionaron de acuerdo con el umbral de P <0,05.

Sobre la base de los datos de matriz de DELs/DECs/DEGs, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson entre DEL/mRNAs y DEC/mRNAs, respectivamente, y el valor umbral de |r|> 0,7 y P < 0,05 para obtener un up-/down -lista de coexpresión regulada entre DEL/mRNAs y DEC/mRNAs. La visualización de la red de coexpresión se calculó y mostró utilizando los 12 algoritmos en el complemento cytohubba. Todos los algoritmos y los diagramas de red resultantes se presentan en las figuras complementarias. S3 y S4.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graphpad Prism 8 (Chicago, EE. UU.). Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (DE). Se realizó la prueba t de Student en los datos restantes, y P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Los datos de secuencia sin procesar informados en este documento se han depositado en el Archivo de secuencias del genoma (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) en el Centro Nacional de Datos de Genómica (Nucleic Acids Res 2022), Centro Nacional de Bioinformación de China / Instituto de Genómica de Beijing, Academia China de Ciencias57,58. Las secuencias en el siguiente formato: https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA010567 y el enlace de trabajo al bioproyecto como https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA012480.

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Agradecemos al Sr. Qiang Fan (Aoji Bio-tech Co., Ltd., Shanghai, China) por ayudar con el análisis de datos.

Centro de Encefalopatía, El Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Anhui, No. 117 Meishan Road, Shushan District, Hefei, 230031, República Popular de China

Daojun Xie, Juan Zhang, Bo Yang, Lei Zhou y Xiaofeng Huang

Facultad de Medicina China y Occidental Integrada, Universidad de Medicina China de Anhui, No. 1 Qianjiang Road, Xinzhan District, Hefei, 230012, República Popular de China

dan wang y biao cai

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DJX, JZ, BC, BY, LZ, XFH y DW concibieron la idea; DW y XFH realizaron búsquedas en la literatura; DW llevó a cabo experimentos con animales y materiales; DW redactó el manuscrito con la ayuda de DJX, JZ, BCDW dibujó la figura y corrigió las referencias con la ayuda de BY, LZ, XFH Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Daojun Xie.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Wang, D., Xie, D., Zhang, J. et al. Análisis exhaustivo de los perfiles de expresión del transcriptoma de ARN codificante y no codificante del tejido del hipocampo en el modelo animal tx-J de la enfermedad de Wilson. Informe científico 13, 9252 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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Recibido: 29 de septiembre de 2022

Aceptado: 05 junio 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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